谢志坚教授团队《Bioactive Materials》：Nell1工程化干细胞细胞外囊泡促进骨缺损修复

近日，浙大口腔谢志坚教授团队在Bioactive Materials杂志上发表了题为Extracellular vesicles derived from neural EGFL-Like 1-modified mesenchymal stem cells improve acellular bone regeneration via the miR-25-5p-SMAD2 signaling axis文章。浙江大学口腔医学博士研究生蓝燕华为本文的第一作者，香港大学博士研究生谢慧之为本文的共同第一作者；浙大口腔谢志坚教授和陈卓副主任医师为通讯作者。该研究报道了利用Nell1基因修饰骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡-水凝胶复合体系（3D-Nell1/EV-hydrogel system），能有效促进大面积骨缺损修复，该工作得到国家自然科学基金的资助。 

研究背景

基于间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的移植能有效的实现组织再生；然而，细胞凋亡、免疫排斥和畸胎瘤形成等限制了它们的应用。研究表明，几乎所有类型细胞都能分泌一种名为细胞外囊泡（EVs）的纳米颗粒，粒径约为30-200nm。囊泡递送被认为是除了细胞直接接触、细胞分泌因子之外的第三种细胞间通信方式。且其具有一些优良的特性，如：内包含丰富的内容物（DNA片段，RNA，脂质蛋白质等）；外具有磷脂双分子层，可以更好的保护其中的“货物”，在体内长时间保持生物活性；可在-80℃储存，解冻后可直接使用。这些优势都使得EVs介导的“无细胞治疗”被认为是干细胞移植的一种具有良好前景的替代方案。尼尔样-1型分子（Neural EGFL-like 1, Nell1）是一种与颅缝早闭症相关的外分泌蛋白，相对于经典的成骨诱导因子骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2, BMP-2），Nell-1具有特异性强、诱导成骨的骨质更为致密、抗炎等优势。先已知Nell1基因有助于骨髓干细胞 (Bone marrow stem cells, BMSCs)的成骨分化，但EVs是否参与这一过程仍然未知。

文章要点 

该研究发现，来源于Nell1基因修饰BMSC的细胞外囊泡（Nell1/EVs）具有较强的诱导干细胞骨向分化的能力。Nell1/EVs主要以“客人带礼物进家门”的作用形式参与细胞间通讯，促进干细胞的成骨向分化。Nell1/EVs的骨诱导能力主要在于显著下调了miR-25-5p。MiR-25-5p 可通过靶向Smad2并抑制SMAD和ERK信号通路的激活来抑制骨生成。此外，基于Nell1/EVs构建的3D-Nell1/EV-水凝胶系统，可实现EVs在骨缺损区域缓慢、持续释放和高浓度保存，有效促进动物体内大范围骨缺损的修复。该研究展现了Nell1/EVs作为无细胞骨再生策略（acellular bone regeneration）的应用前景；机制上，miR-25-5p-SMAD2信号轴的研究扩展了Nell1/EVs 骨诱导能力的相关知识。

图文导读  

（一）Nell1-modified-EVs (Nell1/EVs)的获取，鉴定，及骨诱导能力验证 

（A-C）Nell1过表达的BMSCs（Nell1/BMSCs）构建；（D-F）Nell1/EVs鉴定；（G-H）Nell1/EVs具有诱导干细胞骨向分化的能力。值得注意的是，在Nell1/BMSCs中富集的NELL1蛋白，并没有被分选进入Nell1/EVs中，提示NELL1蛋白本身并不EVs中的主要功能物质。

（二）Nell1/EVs主要以“客人带礼物进家门”的作用形式调控靶细胞 

EVs参与细胞间通讯的方式大体可归结为两种：传递EVs中货物（cargo delivery）和通过膜蛋白直接（surface binding）作用于靶细胞。这两种方式类似于带礼物来做客的客人，和送包裹的快递小哥。前者会把东西送来，并且进家门坐一坐；后者只传递信息，不进家门。研究人员基于细胞在4℃下不存在“胞吞胞饮”的特性，实验证明，Nell1/EVs主要以“客人带礼物进家门”的方式参与靶细胞的调控。

（三）Nell1/EVs的骨诱导能力得益于其中显著下调的miR-25-5p及诱导激活的SMAD/ERK信号通路 

（A）测序显示miR-25-5p在Nell1/EVs中显著下调；（B）miR-25-5p靶向结合Smad2基因；（C-D）miR-25-5p的下调是Nell1/EVs促进干细胞骨向分化的关键

（四）构建的3D-Nell1/EV水凝胶系统可实现EVs的高浓度保存以促进颅骨缺损修复 

（A）3D-Nell1/EV水凝胶系统立体结构；（B）3D-Nell1/EV水凝胶系统的降解和EVs的释放速率；（D）3D-Nell1/EV水凝胶系统有助于EVs在体内局部长时间保存；（E）3D-Nell1/EV水凝胶系统具有良好的促骨修复的能力

总  结

基于干细胞细胞外囊泡的无细胞治疗策略有望成为细胞疗法的替代方案，而工程化的细胞外囊泡已经被研究证明比天然细胞外囊泡具有更强的靶向效果。该研究结果表明，Nell1/EVs结合生物材料的构建可实现良好的组织缺损修复效果，也为Nell1基因对于干细胞骨向分化的机制提供了新的理解。

文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X22000275#appsec1

供稿作者

蓝燕华：浙江大学口腔医学博士研究生，研究方向为细胞外囊泡，骨修复再生。

指导老师

谢志坚：教授、主任医师、博士生导师、求是特聘学者，浙大口腔医院•口腔医学院常务副院长